蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)：又稱為免疫印跡，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，半定量檢測樣品中的某種蛋白的方法。基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析條帶的位置和條帶深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況。那么你知道WB實驗操作步驟有哪幾步嗎？讓我們一起來看看吧！

一、樣本制備蛋白提取

1.前期準(zhǔn)備：首先要了解你所研究蛋白的內(nèi)源表達水平，常用的數(shù)據(jù)庫如Uniport、Atlas、BioGPS，或查閱相關(guān)文獻。設(shè)置陽性對照，選擇內(nèi)參蛋白。

2.蛋白提取：是Western Blotting 的第一步，要求選擇樣本新鮮，降低背景，避免反復(fù)凍融，選擇合適的裂解液裂解樣本，選擇合適的蛋白酶或磷酸酶抑制劑，防止蛋白的降解和磷酸化信號的丟失。

二、蛋白濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法，常用的是BCA法，基本原理是在堿性條件下，蛋白將Cu+ +還原為Cu+，Cu+ 與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

之后加入Loading buffer，含有變性劑，使蛋白質(zhì)變性，釋放二硫鍵，最后煮沸變性保存樣品于-20℃或-80℃。

三、上樣和電泳

1. 制備凝膠：根據(jù)蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠，配膠的APS需要在4℃的冰箱中保存。配膠的試劑中，APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前，需先把其他組分混勻。

2.上樣：蛋白Marker孔加入5-10μL，多選擇生物素化蛋白Marker，其余蛋白總上樣量20-50μg，組織樣本稍多些上樣，盡量保持每個泳道的上樣量一致，空泳道用Loading buffer補齊。

3. 電泳：接上電源后，先用80V恒壓電泳濃縮至溴酚藍指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，成線狀，改為恒壓100v--120v直至溴酚藍電泳到凝膠底部，此過程約用時1.5h。

四、轉(zhuǎn)膜

1.膜的選擇：廣泛使用的是NC膜和PVDF膜

2.轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜的方法包括濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)、干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)是轉(zhuǎn)膜最完quan且應(yīng)用zui廣泛的方法，但是所需時間較長。

五、封閉和抗體孵育

1.封閉：目的是為了減少膜對一二抗的非特異吸附，降低背景。將NC膜從濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)中取出，并用TBST潤洗2次，每次5 min，然后進行封閉。

化學(xué)發(fā)光法：用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡NC膜，室溫搖床封閉1-2h；

熒光法：含5% 脫脂奶粉的TBS，脫脂奶粉需選擇實驗室級別的。

最后再用TBST潤洗封閉后的NC膜3次，每次5 min。

2.抗體孵育：一抗能識別膜上不同種屬的蛋白，買經(jīng)過驗證的，二抗上帶有發(fā)光底物，只能識別一抗。

六、顯色曝光

常用的是化學(xué)發(fā)光，抗體上偶聯(lián)的HRP催化ECL發(fā)光底物顯色，取出洗滌的膜后，用濾紙吸干水分，放置于成像儀上，均勻滴加ECL工作液，排出氣泡，開始曝光。

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